生物學(xué)中“Blotting”方法的簡介及總結(jié)

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簡介：印跡（blotting）是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的檢測和分析方法。印跡（blotting）實(shí)驗(yàn)的過程可以簡單描述為將待檢測的生物大分子經(jīng)電泳等方法分離后轉(zhuǎn)移并固定在膜（如：硝酸纖維素膜、PVDF膜、尼龍膜）上，然后用特異性識別物質(zhì)（如探針）去識別，最后經(jīng)顯色反應(yīng)（同位素放射自顯影、熒光、化學(xué)發(fā)光等）在膜上顯示出結(jié)果：印跡。

最早出現(xiàn)的blotting技術(shù)是Southern Blotting，它是檢測DNA的一種方法。這項(xiàng)技術(shù)由英國生物學(xué)家EdwinSouthern在20世紀(jì)70年代發(fā)明，科學(xué)界便以發(fā)明者的名字來命名這項(xiàng)技術(shù)------SouthernBlotting。1977年，美國斯坦福大學(xué)的JamesAlwine，DavidKemp，和GeorgeStark在PNAS上發(fā)表文章，提出了類似于SouthernBlotting，但卻是用來檢測RNA的技術(shù)。由于跟Southern Blotting比較相近，于是便有了NorthernBlotting這個名稱。后來，GeorgeStark又發(fā)明了用于檢測蛋白質(zhì)的blotting技術(shù)，W. Neal Burnette玩了一把“文字游戲”將這項(xiàng)技術(shù)命名為WesternBlotting，這個名字很快也被廣泛接受并流行起來。

WesternBlotting與Southern Blotting、Northern Blotting的區(qū)別

其實(shí)，WesternBlotting與Southern Blotting、Northern Blotting的技術(shù)原理差別還是比較大的。這種差別體現(xiàn)在Southern Blotting和Northern Blotting是基于DNA和RNA分子之間堿基互補(bǔ)配對的特異性識別能力，而Western Blotting則基于抗原抗體之間特異的免疫反應(yīng)。Southern Blotting和NorthernBlotting時使用帶有標(biāo)記（如同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記）的DNA或RNA探針去識別并結(jié)合到待檢測核酸上，然后直接顯影；而WesternBlotting時要先用待檢測蛋白的“一抗”結(jié)合到待檢測蛋白上，再用可識別“一抗”并偶聯(lián)了某種酶的“二抗去檢測”一抗“，最后通過顯色反應(yīng)的信號來顯示待檢測蛋白的存在與否及量的多少。

另外，Southern Blotting和Northern Blotting兩者比較容易混淆。這兩種技術(shù)最關(guān)鍵的區(qū)別在于待檢測核酸的屬性，如果被檢測的.是DNA，則該技術(shù)就是Southern Blotting，其探針可以是DNA也可以是RNA；類似地，如果被檢測的是RNA，不管探針是RNA還是DNA，該方法就叫作Northern Blotting。

除了以上三種Blotting技術(shù)，還有兩種不太常見的Blotting技術(shù)：EasternBlotting和Southwestern blotting。

Eastern Blotting

是一種檢測蛋白質(zhì)翻譯后修飾的技術(shù)，其檢測目標(biāo)是蛋白質(zhì)上特定的修飾基團(tuán)或部位，如脂肪酸鏈、糖基、磷酸化的氨基酸等等。在EasternBlotting實(shí)驗(yàn)中，通常要先用2D電泳將蛋白質(zhì)分離，然后轉(zhuǎn)到膜上，再用特異的探針去檢測。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是蛋白質(zhì)執(zhí)行功能過程中普遍存在的調(diào)控手段！

Southwesternblotting

是一種檢測DNA和蛋白質(zhì)互作的方法，因此才有Southwestern之稱。首先用SDS-PAGE的方法將蛋白質(zhì)分離開來并轉(zhuǎn)移到膜上，然后在尿素的存在下去除SDS使蛋白盡可能復(fù)性，最后用帶標(biāo)記的特定序列的DNA探針去檢測。

以上簡單介紹的幾種Blotting技術(shù)都以檢測某種生物大分子的存在（或量的多少）為目的，所使用的去識別待檢測物質(zhì)的探針或抗體與待檢測物質(zhì)之間的結(jié)合是已知的、確定的。在這一點(diǎn)上做文章，就可以把blotting技術(shù)推廣到驗(yàn)證蛋白質(zhì)相互作用這個領(lǐng)域。

Far-westernblotting是一種基于western blotting的分子生物學(xué)方法，在western blotting中用抗體來檢測目標(biāo)蛋白，而在far-westernblotting中用能夠與目標(biāo)蛋白結(jié)合的非抗體蛋白質(zhì)。因此，westernblotting用來檢測特定的蛋白而far-western blotting則用于檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用。

在傳統(tǒng)的western blotting中，凝膠電泳被用來從樣品中分離蛋白質(zhì)，然后這些蛋白質(zhì)在blotting過程中被轉(zhuǎn)移到膜上。目標(biāo)蛋白在westernblot中被抗體探針識別。far-western blotting用非抗體蛋白來檢測目標(biāo)蛋白，通過這種方式，與探針結(jié)合的蛋白質(zhì)就被檢測出來了。探針蛋白經(jīng)常通過一種表達(dá)克隆載體在大腸桿菌中被生產(chǎn)出來。

探針蛋白可以通過一種常規(guī)的方法——放射自顯影顯現(xiàn)出來，它可以結(jié)合像His或FLAG的特殊的親和標(biāo)簽或者蛋白質(zhì)的特殊抗體。因此在凝膠電泳前將細(xì)胞提取液在煮沸的去垢劑中失活是檢測不需要自然折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)相互作用重要方法。

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