淺談銅對(duì)海菜花種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響論文
海菜花( Ottelia acuminatas ) 屬于水鱉科( Hydrocharitaceae ) ，是中國(guó)特有三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)高原淡水植物，其生長(zhǎng)對(duì)水質(zhì)要求很高，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)具有重要的生態(tài)作用。近年來(lái)，隨著環(huán)境中重金屬污染加劇，水質(zhì)惡化，中國(guó)海菜花的分布急劇減少，而重金屬對(duì)海菜花種子發(fā)芽的毒害作用還鮮見(jiàn)報(bào)道。銅( Cu2+ ) 作為植物生長(zhǎng)過(guò)程中一種重要的微量元素，對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育有著重要影響。但Cu2+ 可在植物體內(nèi)誘發(fā)產(chǎn)生過(guò)氧化氫、超氧陰離子、羥基自由基等活性自由基，可以氧化生物大分子，甚至使細(xì)胞死亡，從而對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用。因此，本試驗(yàn)以海菜花種子為試材，探討重金屬Cu2+ 對(duì)海菜花種子萌發(fā)和抗氧化酶系統(tǒng)的影響，初步揭示銅對(duì)海菜花毒性的作用機(jī)理，以期為海菜花的保護(hù)提供一定的理論支持。
1 材料與方法
1. 1 試驗(yàn)材料
供試海菜花種子于2013 年11 月上旬采自貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)花溪水庫(kù)，挑選籽粒飽滿，大小均勻的種子用于試驗(yàn)。各分析純、生化純?cè)噭┒加贸兯渲啤?/p>
1. 2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
將用分析純CuSO4·5H2 O 和1 /10 濃度Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制Cu2+ 濃度分別為0mg /L、0. 1mg /L、0. 2mg /L、0. 5mg /L、1mg /L、2mg /L、5mg /L、10mg /L 溶液，置于鋪有2 層濾紙的直徑9cm 培養(yǎng)皿中，分別挑選飽滿的海菜花種子各20 粒，蓋好玻璃培養(yǎng)皿，置于溫度25±1℃，光照強(qiáng)度2 000lx，14h /d，濕度80%的人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。樣品放入后每天添加適量的超純水補(bǔ)償損失水分。種子露白即認(rèn)作發(fā)芽，培養(yǎng)14d 后測(cè)定葉綠素、類胡蘿卜素、可溶性蛋白含量，超氧化物歧化酶( SOD ) 、過(guò)氧化物酶( POD) 和過(guò)氧化氫酶( CAT) 活性。
1. 3 分析方法
1. 3. 1 發(fā)芽指標(biāo)測(cè)定方法發(fā)芽率( GR) = 14d 內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%; 發(fā)芽勢(shì)( GP) = 萌發(fā)前7d 發(fā)芽數(shù)之和/供試種子數(shù)×100%; 發(fā)芽指數(shù)( GI) = ΣGt /Dt ( Gt 為第t 天的發(fā)芽數(shù); Dt 為相應(yīng)發(fā)芽天數(shù)) ; 活力指數(shù)= GI×S ( GI 為發(fā)芽指數(shù); S 為幼苗平均總長(zhǎng)度，單位cm) 。
1. 3. 2 葉綠素、類胡蘿卜素含量測(cè)定取處理幼苗相同葉齡部位葉0. 5g，以80% 丙酮提取， 用分光光度計(jì)測(cè)定665nm、649nm、470nm 吸光度。
1. 3. 3 SOD、POD、CAT 活性和可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定取處理植株相同葉齡葉片，加入少量0. 1mol /LpH7. 8 的磷酸緩沖液，置冰浴研磨勻漿，離心( 12 000 r /min，4℃，15min) ，上清液用于酶活性與可溶性蛋白含量的測(cè)定。SOD 活性測(cè)定采用NBT 光化還原法，POD 活性采用愈創(chuàng)木酚法，CAT 活性采用南京建成科技有限公司CAT 試劑盒測(cè)定�？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍(lán)G-250 法測(cè)定。
1. 4 數(shù)據(jù)處理與分析
所得數(shù)據(jù)用SPSS13. 0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，變化趨勢(shì)圖用origin8. 0 繪制。
2 結(jié)果與分析
2. 1 銅脅迫對(duì)海菜花種子發(fā)芽的影響
在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各濃度Cu2+處理的海菜花種子發(fā)芽率與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異( p>0. 05) 。海菜花種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)整體表現(xiàn)出隨Cu2+ 處理濃度的增加呈下降趨勢(shì)，當(dāng)Cu2+ 處理濃度較高時(shí)，與對(duì)照差異顯著( p<0. 05) 。
2. 2 銅脅迫對(duì)海菜幼苗生長(zhǎng)的影響
各濃度Cu2+脅迫處理下，海菜花幼苗長(zhǎng)度、根長(zhǎng)、根數(shù)均隨Cu2+ 離子濃度增加而下降，且均與對(duì)照差異顯著( p<0. 05) ; 當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到10mg /L 時(shí)，海菜花的幼苗長(zhǎng)抑制率達(dá)到88. 2%，根的生長(zhǎng)被100% 抑制。Cu2+ 脅迫質(zhì)量濃度<0. 5mg /L 時(shí)，Cu2+ 離子對(duì)幼苗葉片數(shù)無(wú)明顯影響，當(dāng)Cu2+ 濃度≥1mg /L 時(shí)，海菜花幼苗葉片數(shù)隨Cu2+離子濃度的升高而減少，且與對(duì)照差異顯著( p<0. 05) 。
由此說(shuō)明，隨著Cu2+ 脅迫濃度的增大，Cu2+對(duì)海菜花幼苗生長(zhǎng)的抑制作用增大。136 西 部 林 業(yè) 科 學(xué) 2016 年2. 3 銅脅迫對(duì)海菜花光合色素含量的影響葉綠素含量很大程度上反映了植物的光合作用能力，葉綠素與光合速率、營(yíng)養(yǎng)狀況關(guān)系密切，逆境條件下，葉綠素含量是表征植物受傷害程度的指標(biāo)之一。
2. 4 銅對(duì)海菜花葉片中抗氧化酶系統(tǒng)的影響
SOD、POD、CAT 3 種抗氧化酶活性與植物抵御外界脅迫能力密切相關(guān)。Cu2+ 在0～ 10mg /L 范圍內(nèi)，SOD 活性整體表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)Cu2+ 濃度為1mg /L 時(shí)，SOD 活性最大，為對(duì)照的11. 43 倍，且與對(duì)照差異顯著( p第2 期 朱健等: 銅對(duì)海菜花種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響 137<0. 05) ; 當(dāng)Cu2+濃度為10mg /L 時(shí)，SOD 活性仍比對(duì)照高3. 3 倍。POD 活性變化規(guī)律與SOD 相似，也呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，Cu2+ 濃度為2mg /L 時(shí)，POD 活性達(dá)到最高值，且與對(duì)照差異顯著( p <0. 05) ，但在最大10mg /L Cu2+ 處理時(shí)，其活性與對(duì)照無(wú)顯著差異。
由此可見(jiàn)，SOD 的耐受性比POD 強(qiáng)。而CAT 活性的變化規(guī)律則與SOD、POD活性的變化規(guī)律不同，表現(xiàn)出隨Cu2+ 濃度升高而逐漸降低，且均與對(duì)照差異顯著( p < 0. 05) 。當(dāng)Cu2+濃度為10mg /L 時(shí)，海菜花幼苗的CAT 活性被抑制了83. 9%，由此可見(jiàn)，CAT 對(duì)Cu2+ 脅迫的.耐受性較差。2. 5 銅對(duì)海菜花幼苗中可溶性蛋白質(zhì)含量的影響植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)主要是參與各種代謝的酶類，其含量是了解植物體生理的一個(gè)重要指標(biāo)。隨著Cu2+處理濃度的增加，海菜花幼苗中的可溶性蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在Cu2+ 處理濃度為5mg /L 時(shí)，達(dá)到最大值，且與對(duì)照差異顯著( p < 0. 05) ，隨后開(kāi)始下降，由此表明，海菜花在受Cu2+ 脅迫時(shí)體內(nèi)能產(chǎn)生一些抗性蛋白抵御外界脅迫，但處于高濃度Cu2+脅迫時(shí)，這種抵御機(jī)制受到破壞，可溶性蛋白質(zhì)含量降低。SOD、POD 活性先升高后降低的變化趨勢(shì)也證明了可溶性蛋白質(zhì)含量的這種變化規(guī)律。
3 討論
試驗(yàn)結(jié)果表明，Cu2+脅迫對(duì)海菜花種子的發(fā)芽率無(wú)顯著影響是由于其種皮的保護(hù)作用。種子萌發(fā)前期階段主要利用種子自身儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，外部污染物質(zhì)無(wú)法進(jìn)入其內(nèi)部參與萌發(fā)的前期過(guò)程，所以對(duì)其發(fā)芽率無(wú)顯著影響。然而與發(fā)芽率不同的是海菜花種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)隨著外源Cu2+濃度的增大而呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，這與程召貫等對(duì)小麥( Triticum aestivum) 種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。說(shuō)明高濃度的Cu2+ 對(duì)海菜花種子萌發(fā)具有抑制作用，其可能是高濃度Cu2+ 能部分通過(guò)種皮進(jìn)入種子內(nèi)部，抑制了海菜花種子的萌發(fā)。
幼苗生長(zhǎng)過(guò)程和種子萌發(fā)過(guò)程營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用途徑不同，因此幼苗生長(zhǎng)過(guò)程的Cu2+ 脅迫與發(fā)芽階段的Cu2+脅迫影響不同。Cu2+脅迫對(duì)海菜花幼苗的芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、葉片數(shù)和根數(shù)均有不同程度的影響，高濃度的Cu2+ 脅迫對(duì)海菜花幼苗的芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)、葉片數(shù)和根數(shù)有顯著的抑制作用，這與肖志華等對(duì)不同基因型谷子( Setaria italica ) 幼苗的Cu2+脅迫研究結(jié)果一致。這主要是由于過(guò)量Cu2+ 加速了海菜花幼苗體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，抑制各種酶活性，影響到海菜花幼苗和根系的生長(zhǎng)。本次試驗(yàn)中，海菜花種子在受到Cu2+ 脅迫時(shí)138 西 部 林 業(yè) 科 學(xué) 2016 年葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均下降，這與Cu2+脅迫對(duì)多花黑麥草( Lolium multiflorum) 綠葉素的影響規(guī)律一致。其原因可能是: 首先，高含量Cu2+抑制了PSⅡ的電子傳遞過(guò)程，減弱了光合作用強(qiáng)度，減少了葉綠素的合成; 其次，Cu2+脅迫增加活性自由基的產(chǎn)生而氧化葉綠素，導(dǎo)致葉綠素含量的降低，最終引起光合速率的下降; 再次，可能是海菜花攝入過(guò)量的Cu2+ 與葉綠素合成的某些酶( 原葉綠素酸酯還原酶、膽色素原脫氨酶、8-氨基乙酰丙酸合成酶) 的-SH 結(jié)合，改變了酶的構(gòu)象，使酶失活，進(jìn)而造成光合色素含量的下降。SOD、POD 和CAT 是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的3 個(gè)重要保護(hù)酶，它們發(fā)揮協(xié)同作用，消除活性氧，保護(hù)植物膜系統(tǒng)。隨著Cu2+ 處理濃度的增加，SOD 和POD 活性都是先升后降，這與Cu2+ 對(duì)三葉草( Trifolium incarnatum) 、狗牙根( Cynodon dactylon)、雙穗雀稗( Paspalum paspaloides) 等葉片中SOD、POD 酶活性變化規(guī)律一致。由此表明低濃度的Cu2+ 對(duì)POD 與SOD 活性具有激活作用，隨著Cu2+ 濃度的逐漸增大，又轉(zhuǎn)為抑制作用。而CAT 活性則隨著Cu2+ 濃度增大而逐漸降低。由此可見(jiàn)，海菜花幼苗受Cu2+ 脅迫后抗氧化酶系統(tǒng)反饋機(jī)制不同，CAT、POD、SOD 活性呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。陳國(guó)祥等認(rèn)為低濃度的重金屬逆境脅迫會(huì)抑制植物根系對(duì)養(yǎng)分、水分的吸收，同時(shí)引發(fā)活性氧( ROS) 積累，增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，使得SOD 與POD 活性增強(qiáng)。本試驗(yàn)中，在低濃度Cu2+脅迫下，海菜花為有效緩解Cu2+脅迫引起的氧化脅迫，及時(shí)清除ROS 的積累，SOD 與POD 活性增強(qiáng)也充分證實(shí)了此觀點(diǎn)。但隨著Cu2+ 濃度的進(jìn)一步增加，高濃度的Cu2+ 導(dǎo)致海菜花幼苗中活性氧等自由基的積累超過(guò)植物本身的耐受極限，轉(zhuǎn)而開(kāi)始抑制SOD 與POD 的活性。
試驗(yàn)Cu2+ 濃度范圍內(nèi)CAT 活性逐漸降低，這可能是海菜花種子CAT對(duì)Cu2+敏感，不能抵御外來(lái)污染物脅迫，這也可能是其耐受性較差的原因之一。海菜花幼苗中的可溶性蛋白是植物細(xì)胞內(nèi)未與膜系統(tǒng)特異結(jié)合的酶，其含量越高說(shuō)明其體內(nèi)生理生化反應(yīng)與代謝活性越旺盛，有利于植物抵御逆境脅迫。在本文研究Cu2+ 濃度范圍內(nèi)，可溶性蛋白質(zhì)含量先升高后降低的變化趨勢(shì)與Cu2+ 對(duì)谷子幼苗可溶性蛋白質(zhì)的影響結(jié)果相同。其原因可能一方面是適量的Cu2+ 可以誘導(dǎo)合成一些新蛋白質(zhì)，參與抗逆性生理活動(dòng)，促進(jìn)可溶性蛋白質(zhì)含量的增加; 另外一方面高濃度的Cu2+ 也誘導(dǎo)了蛋白水解酶活性增強(qiáng)，加速了蛋白質(zhì)的水解，同時(shí)，高濃度的Cu2+脅迫導(dǎo)致海菜花抗氧化酶系統(tǒng)受損，抗性酶減少，從而導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)含量減少。
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