關于大鼠羊膜細胞體外培養(yǎng)及其干細胞標記物的表達
羊膜位于胎盤絨毛膜內(nèi)側(cè)，是一層無血管、神經(jīng)、淋巴和肌肉的透明薄膜，可起到對胎兒的保護作用，與發(fā)育中的胎兒聯(lián)系緊密。人源羊膜細胞在受精后第8 天開始形成，具有多項分化的潛能，可向三個胚層細胞進行分化，近年來研究表明，羊膜上皮細胞能夠分化為成熟的神經(jīng)細胞，并合成釋放多巴胺、乙酰膽堿、去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)。人羊膜細胞具有低免疫原性和有效的免疫抑制力，細胞移植后不會發(fā)生急性排斥反應。本實驗從大鼠羊膜分離獲取羊膜細胞，建立穩(wěn)定培養(yǎng)的條件，并對其生物學特性進行了探討，為其將來在細胞移植治療方面的應用提供實驗依據(jù)。
1 材料和方法:
1. 1 材料
1. 1. 1 主要儀器:CO2培養(yǎng)箱、凈化工作臺、倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡、流式細胞儀。
1. 1. 2 主要試劑:DMEM 高糖培養(yǎng)基( Dulbeccosmodified Eagles medium，DMEM)、人表皮生長因子(EGF)、0.25%含 EDTA 的胰蛋白酶(0. 25% trysin-EDTA)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、抗生素(penicillin，streptomycin)、PBS 緩沖液購自于 Gibco公司。Oct-4、Sox-2、SSEA-4、nestin、vimentin、BDNF、NGF、CD90 購自與 Abcam 公司。CD29、CD44 購自于 eBioscience 公司、CD45、CD11b 購自于 BD 公司。
1. 1. 3 實驗動物:SPF 級孕 18 ～ 18. 5 d 的 SD 大鼠，購自中國軍科院實驗動物中心，許可證號:[SCXK-(軍)2014-0004]，實驗動物使用批準號:ILAS-PL-2014-001。在無菌條件下進行實驗操作分離羊膜組織。
1. 2 方法
1. 2. 1 羊膜細胞分離及培養(yǎng):SD 孕鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉(0. 01 mL /g)，麻醉后，無菌條件下開腹，機械性分離子宮層，剝離胎盤，分離羊膜組織置于含有500 U/mL 雙抗的 PBS 溶液中沖洗。將羊膜組織放置在含有500 U/mL 雙抗的 DMEM 基礎培養(yǎng)基中，無菌眼科剪將其剪至1 mm3左右的小塊。將組織懸液移至50 mL 離心管中，1 000 r/min 離心 5min，棄上清液。加入 0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶10 mL，37℃ ，5% CO2條件下消化 20 ～30 min。用含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化。200 目不銹鋼濾網(wǎng)過濾單細胞懸液，接種至 25 cm2培養(yǎng)瓶，含10% FBS、10 g/LEGF 和 500 U/mL 雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天細胞換液，2 ～ 3 d 后細胞長滿培養(yǎng)瓶85% ～90%時，進行細胞傳代。
1. 2. 2 流式細胞術檢測:取培養(yǎng) 2 ～ 4 代細胞，用0. 25% 含 EDTA 的胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基終止消化。細胞計數(shù)將其稀釋成1 106個，每個流式管1 mL 細胞懸液。每流式管加2 mL PBS 使細胞混勻，2 000 r/min 離心5 min，棄上清液。重復加2 mL PBS 重懸細胞，2 000 r/min離心5 min，棄上清液。每管加 50 L PBS 重懸細胞，加 抗 體 CD29-PE-Cy7、CD44-PE、CD90-FITC、CD45-PE-CY7、CD11b-APC，避光室溫孵育 30 min。每管加2 mL PBS 重懸細胞2000 r/min 離心5 min，棄上清液。各管加300 L PBS 重懸細胞上機檢測。
1. 2. 3 免疫熒光細胞染色:取 2 ～ 4 代細胞，0. 25%含 EDTA 胰蛋白酶消化，含 10% FBS 的. DMEM 完全培養(yǎng)基終止消化。加入完全培養(yǎng)基重懸，至24 孔板中培養(yǎng)。待細胞增殖至 70% 作用時，PBS 沖洗，4% 多聚甲醛(預冷)固定 10 min。PBS 沖洗 2 次，每次5 mim。1% Tuiton-100 孵育10 min。PBS 沖洗2 次，每次 5 mim。山羊血清工作液每孔 100 L 室溫下封閉30 min。吸去山羊血清工作液，抗體稀釋液稀釋抗體 Oct-4(1∶ 200)、Sox-2(1∶ 200)、SSEA-4(1∶200)、nestin(1∶100)、vimentin(1∶100)，每孔100L，4℃過夜孵育。PBS 沖洗 3 次，每次 5 min。避光條件下，PBS 稀釋 FITC 標記的羊抗鼠二抗(1∶200)，37℃避光孵育 30 min。PBS 沖洗 3 次，每次5 min。DAPI 封片劑封片。共聚焦熒光顯微鏡觀察。
1. 3 統(tǒng)計學方法實驗結(jié)果采用 x珋 s 表示，使用 SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，對其進行單因素方差分析和LSD 檢驗，P 0. 05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。
2 結(jié)果
2. 1 分離細胞培養(yǎng)分離培養(yǎng)大鼠羊膜細胞，鏡下，細胞呈變形蟲樣生長(圖 1a)，生長速度快(圖 1b)，需隔天換液傳代。本實驗中大鼠羊膜細胞可傳至6 ～7 代。
2. 2 流式細胞術鑒定細胞表面抗原結(jié)果經(jīng)流式細胞術鑒定大鼠羊膜細胞間充質(zhì)細胞表面標記物 CD29、CD44 分別為97. 6%和95. 8%。細胞表面抗原CD90、CD45 幾乎不表達，CD11b 有少量表達(圖2 見文后彩插6)。
2. 3 細胞免疫熒光鑒定細胞表面標記物結(jié)果本實驗通過細胞免疫熒光方法檢測大鼠羊膜細胞表達干細胞標記物 Oct-4 和 Sox-2(如圖 3)，神經(jīng)干細胞標記物 nestin 和間充質(zhì)干細胞標記物vimentin(如圖 4)，( 圖 3 ～ 4 見文后彩插 7) 并表達胚胎干細胞標記物 SSEA-4(如圖 5)�？杀磉_神經(jīng)營養(yǎng)因子 BDNF 和NGF(如圖6)(圖5 ～6 見文后彩插8)。
3 討論
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通過細胞免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)大鼠羊膜細胞表達干細胞表面標記物 Oct-4 和 Sox-2，間充質(zhì)細胞標記物 vimentin 和神經(jīng)細胞標記物 nestin，表達 SSEA-4。可表達神經(jīng)營養(yǎng)因子標記物 BDNF 和 NGF，這些神經(jīng)營養(yǎng)因子是神經(jīng)元生長與存活所必需的蛋白質(zhì)分子。羊膜細胞表達間充質(zhì)干細胞標記物 CD29和 CD44，其表達量均在95%以上，CD45、CD90 幾乎不表達，CD11-b 有少量表達。Oct-4 可參與胚胎干細胞的自我更新，調(diào)節(jié)胚胎干細胞的多分化潛能。有研究指出 Oct-4 在羊膜細胞核內(nèi)及細胞質(zhì)均可表達。Miki 等人研究結(jié)果表明人羊膜上皮細胞和間充質(zhì)細胞都可表達 Sox-2、Oct-4 等干細胞標志物。本實驗結(jié)果顯示在大鼠羊膜細胞中 Oct-4 在胞核和胞質(zhì)中均有表達。Nestin 被認為是在胚胎和成體組織中的多能性神經(jīng)干細胞的標記物。在有絲分裂活躍的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)細胞中表達，現(xiàn)作為神經(jīng)干細胞的標記物被廣泛應用。人羊膜來源的間充質(zhì)干細胞經(jīng)體外誘導分化，可分化為神經(jīng)樣細胞并表達 nestin、Oct-4 和 Sox-2。Vimentin 起到維持細胞形態(tài)，胞質(zhì)完整性和穩(wěn)定細胞骨架的作用。有研究發(fā)現(xiàn)在妊娠 15 d 的大鼠胚胎中檢測有nestin 和 vimentin 的表達，人羊膜細胞未分化的前體細胞中也存在 nestin、vimentin 表達。
有研究發(fā)現(xiàn)大鼠羊膜細胞和人羊膜細胞中都表達 nestin 和vimentin 因子。SSEA-4 被認為是特異性人胚胎干細胞和卵泡期胚胎早期卵裂的標記物，也被視為成體間充質(zhì)干細胞的標記物。Ilancheran 等與他的同事 MIKI 等分別通過實驗證明了人羊膜上皮細胞表達胚胎干細胞表面標記物 SSEA-4。本實驗通過細胞免疫熒光方法檢測出大鼠羊膜細胞表達 nestin、vimentin 和 SSEA-4。NGF 和 BDNF 都是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中成員。NGF 同時也是一種信號分子，缺乏 NGF 對神經(jīng)元的營養(yǎng)作用，神經(jīng)元會出現(xiàn)凋亡。BDNF 可促進神經(jīng)元的存活并能支持神經(jīng)元和突觸的生長和中國比較醫(yī)學雜志 2015 年 4 月第 25 卷第 4 期 Chin J Comp Med，April 2015，Vol. 25. No. 436分化。BDNF 可減少突觸喪失、矯正部分異�；虮磉_、阻止神經(jīng)元萎縮且改善與年齡相關的認知障礙，提高學習記憶能力。研究人員發(fā)現(xiàn)人羊膜上皮細胞和人羊膜間充質(zhì)細胞可合成釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子 BDNF、NGF 和 NT-3，其他的神經(jīng)營養(yǎng)因子通過細胞培養(yǎng)后檢測沒有表達。多個實驗證實通過移植人羊膜細胞到損傷部位能修復受損 傷 的 神 經(jīng) 元，BDNF 的 表 達 水 平 同 時 增加，說明人羊膜細胞很可能通過釋放 BDNF 來修復損傷神經(jīng)元的功能。本實驗中通過細胞免疫熒光方法也發(fā)現(xiàn)大鼠羊膜細胞表達神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF 和 NGF。
人羊膜間充質(zhì)細胞可表達間充質(zhì)細胞標記物CD29、CD44、CD73、CD90、CD166 和 CD105，不表達骨髓造血標記物 CD34 和 CD45、單核細胞標記物CD114 和巨噬細胞標記物 CD11b。Murphy等在研究人羊膜上皮細胞特點時發(fā)現(xiàn)，人羊膜上皮細胞表達上皮粘附分子 EpCAM，幾乎不表達 CD90和 CD105。而人羊膜間充質(zhì)細胞表達 CD90、CD73 和 CD105，其表達量都在 95% 以上，CD45、CD34 表達量少于 2%。Bailo 等發(fā)現(xiàn)人羊膜細胞表達 CD105、CD73、CD90 和 CD29，不表達 CD34、CD45、CD14 和 CD3[18]。本實驗中通過流式細胞術方法檢測到大鼠羊膜細胞表達 CD29 和 CD44，不表達 CD90、CD45，少量表達 CD11b。羊膜細胞易于分離培養(yǎng)，細胞生長速度快，免疫原性低，并有向三個胚層分化的潛能，在相關疾病的治療中具有很好的前景。本實驗較為系統(tǒng)地檢測了大鼠羊膜細胞的四類干細胞標記物，發(fā)現(xiàn)大鼠羊膜細胞可表達干細胞表面標記物 Oct-4 和 Sox-2、胚胎干細胞標記物 SSEA-4、間充質(zhì)干細胞標記物vimentin 和神經(jīng)干細胞標記物 nestin，并同時還表達神經(jīng)生長因子 BDNF 和 NGF。由此，我們推測大鼠羊膜細胞很可能具有某些間充質(zhì)干細胞和神經(jīng)干細胞的特性，為相關基礎研究和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了一些線索。
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