定量RT-PCR中人干細(xì)胞因子的RNA-CRS的構(gòu)建

定量RT-PCR中人干細(xì)胞因子的RNA-CRS的構(gòu)建

一種適用于定量RT-PCR、用ExonucleaseⅢ部分酶切剔除技術(shù),構(gòu)建人干細(xì)胞因子(hSCF)基因的RNA競爭性參考標(biāo)準(zhǔn)(RNA-CRS)的新方法:用RT-PCR技術(shù),從HepG2細(xì)胞中擴(kuò)增出全長人hSCF cDNA,并克隆入質(zhì)粒pGEM-T獲重組的pGEMSCF載體,經(jīng)ExonucleaseⅢ和S1核酸酶適當(dāng)處理,以導(dǎo)致hSCF cDNA中一小片段缺失,由此獲得重組pGEMSCF模擬體(mimic),經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄得到hSCF RNA-CRS.測序表明:該RNA-CRS與hSCF mRNA比較,缺失了從第499位至608位共110個(gè)核苷酸,但二者RT-PCR反應(yīng)可用同一對擴(kuò)增引物,反應(yīng)動(dòng)力學(xué)極為相似.這種hSCF RNA-CRS可作為一種較理想的競爭性參考標(biāo)準(zhǔn),適用于定量RT-PCR中,以對重組hSCF在真核細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析.此方法亦可推廣應(yīng)用于其他真核基因的表達(dá)水平及/或調(diào)控的檢測和研究.

作 者： 譚文斌 聶怡玲 羅賽群 郭小珊 成光杰 陳漢春 朱定爾 TAN Wen-Bin NIE Yi-Ling LUO Sai-Qun GUO Xiao-Shan CHENG Guang-Jie CHEN Han-Chun ZHU Ding-Er   作者單位： 湖南醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)研究中心,長沙,410078  刊 名： 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展  ISTIC SCI PKU 英文刊名： PROGRESS IN BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS  年，卷(期)： 2000 27(3)  分類號： Q7  關(guān)鍵詞： 基因表達(dá)定量   定量RT-PCR   人干細(xì)胞因子基因  

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