超高壓水射流技術(shù)對(duì)葛根藥材化學(xué)成分影響研究
1、儀器與材料
LC-20AT高效液相色譜儀，包括LC-20AT泵、SPD-20A紫外檢測(cè)器、AT-330柱溫箱、Class-VP數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、7725i進(jìn)樣閥（日本島津公司）；DPSB-3040型超高壓水射流系統(tǒng)（南京大地水刀股份有限公司）。
葛根為市售，經(jīng)本院王盛民教授鑒定為豆科植物野葛Pueraria lobata Ohwi的干燥根；葛根素對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110752-200511）；甲醇為HPLC級(jí)（美國(guó)Fisher公司）；所用水為超純水；其余試劑均為分析純。
2、方法與結(jié)果
2.1 供試品溶液的制備稱取葛根藥材粗粉約500 g，精密稱定，10倍量80%的乙醇回流提取3次，2 h/次，合并提取液，過(guò)濾，減壓濃縮，回收乙醇至無(wú)醇味，溶液定容至2 000 ml。量取葛根提取液200 ml，用超純水稀釋至20 L，分別在150，200，250，300和350 MPa壓力條件下，經(jīng)超高壓水射流處理，將各溶液搖勻、靜置，分別取未經(jīng)處理和各處理液的上清液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，標(biāo)號(hào)為0，1，2，3，4，5號(hào)，作為供試品溶液。
2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取葛根素對(duì)照品12.0 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻；精密量取2 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每毫升含葛根素96 μg）。
2.3 葛根的薄層色譜鑒別照薄層色譜法實(shí)驗(yàn)［2］，吸取“2.1”和“2.2”項(xiàng)制備的供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，使成條狀，以三氯甲烷-甲醇-水（7∶2.5∶0.25）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出晾干，置日光燈下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)。斑點(diǎn)較為圓整，分離效果好，各供試品斑點(diǎn)大小及Rf值無(wú)顯著差異。
2.4 HPLC色譜條件Symmetry?C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（美國(guó)Waters）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（25∶75）；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；流速1.0 ml·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl。在該色譜條件下，理論塔板數(shù)按葛根素峰計(jì)算不低于4 000，且樣品中葛根素與其他組分分離良好，對(duì)照品及樣品的色譜圖見(jiàn)圖1。
2.5 線性關(guān)系考察分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下制備的葛根素對(duì)照品溶液2，4，6，8，10 μl進(jìn)樣測(cè)定，記錄各峰面積。以葛根素進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，得回歸方程Y=704 877.60X-653.88，r=0.999 9。結(jié)果表明葛根素在0.192～0.960 μg濃度范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。
2.6 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取葛根素對(duì)照品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，得RSD為1.65%。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取“2.1”項(xiàng)未經(jīng)超高壓水射流處理的供試品溶液，同法分別于2，4，6，8，24 h測(cè)定，進(jìn)樣10 μl/次，結(jié)果RSD為1.37%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批樣品粉末，按樣品含量測(cè)定法同法測(cè)定5次，RSD為2.38%，表明該測(cè)定方法重復(fù)性比較好。加樣回收實(shí)驗(yàn)采用加樣回收法，稱取已知含量的葛根藥材5份，精密稱定，再分別精密加入葛根素對(duì)照品溶液 （0.20 mg·ml-1）20 ml，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μl，記錄色譜圖，結(jié)果葛根素平均回收率為96.1%，RSD為1.14%（n=5）。
本文研究結(jié)果表明，不同壓力的水射流處理葛根醇提液后，處理液的溫度由進(jìn)樣溫度19.8℃隨壓力的升高上升至51.8℃；葛根的薄層圖譜中斑點(diǎn)的個(gè)數(shù)、大小及Rf值無(wú)明顯差別；葛根的'液相圖譜中峰的個(gè)數(shù)及形狀亦無(wú)明顯差別，作為葛根藥材的指標(biāo)性成分葛根素，其含量均符合藥典規(guī)定。經(jīng)過(guò)150，200，250，300 和350 MPa不同壓力水射流處理液中葛根素的含量都較原液升高，尤其以經(jīng)350 MPa壓力水射流處理液中葛根素含量最高，其原因可能是，由于葛根素本來(lái)就存在于葛根最外部的木栓層下的外部薄壁組織中，經(jīng)過(guò)超高壓水射流技術(shù)的瞬時(shí)卸壓、高速撞擊、高剪切和熱協(xié)同作用產(chǎn)生膨化效應(yīng)，破壞了藥材中微生物的細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，同時(shí)引發(fā)對(duì)壓力敏感的非共價(jià)鍵（氫鍵、離子鍵、疏水鍵等）的破壞［5］，使得葛根素更容易浸出 。
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