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蛋白提取及WB步驟
Western blot 實(shí)驗(yàn) 1）蛋白裂解液的配制:
Urea（7 M）4.2 g，Thiourea（2 M）1.52 g，CHAPS（4% W/V）0.4 g，DTT（1% W/V）0.1 g，ddH2O加至10 ml，1 ml/管分裝-20℃保存?zhèn)溆茫? ml分裝的裂解液中用前加入 Cocktail（1% V/V）10 μl，混勻后于冰上放置備用。
我們用的是國(guó)產(chǎn)的碧云天的全蛋白提取試劑盒 2）蛋白樣品制備
（1）取組織，稱(chēng)重，按照W:V = 1:6的比例加入蛋白裂解液； （2）用勻漿器對(duì)組織進(jìn)行勻漿，勻成糊狀。 （3）4 ℃，冰上放置30min，每10 min振蕩一次；
（4）4 ℃，12000 g 離心30 min，吸上清，分裝置于-70 ℃待用。 3）蛋白濃度測(cè)定（Bradford法） 試劑配制：
考馬斯亮藍(lán)染色液：考馬斯亮藍(lán)G250 0.05 g，95%乙醇25 ml，H3PO4 50 ml，ddH2O加至500 ml，過(guò)濾后儲(chǔ)存于4 ℃。
牛血清白蛋白（BSA）：1 mg/ml
步驟：按下列體系配置溶液，混勻后，靜置5 min后，測(cè)OD值（波長(zhǎng)595 nm），將OD值輸入Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算出相關(guān)系數(shù)，當(dāng)相關(guān)系數(shù)>0.99才具有可信度。取待測(cè)標(biāo)本，正確設(shè)置reference，取適量標(biāo)本，進(jìn)行濃度測(cè)定。
管 號(hào) 0 1 2 3 4 5
BSA（1 mg/ml）
0 5 10 15 20 25
0.9% NaCl/0.1 M PBS
200 μl 195 μl 190 μl 185 μl 180 μl 175 μl
考染液 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
我們用的是國(guó)產(chǎn)碧云天的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。 4）聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） （1）凝膠制備：
30.8%丙烯酰胺：丙烯酰胺30 g，甲叉雙丙烯酰胺0.8 g，ddH2O加至100 ml，
置于通風(fēng)櫥內(nèi)攪拌直至丙烯酰胺完全溶解，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后4 ℃保存于棕色瓶中備用。
1.5M Tris（pH8.8）：Tris 18.17 g，HCl調(diào)至pH8.8，ddH2O至100 ml； 經(jīng)驗(yàn)配制：配制1.5 M Tris（pH8.8）500 ml時(shí)直接加入10 M HCl（即HCl原液）15 ml，不用再調(diào)pH。
0.5M Tris（pH6.8）：Tris 6.057 g，ddH2O加至100 ml，HCl調(diào)至pH 6.8。 10%SDS：SDS 1 g，ddH2O加至10 ml。
10%過(guò)硫酸銨：過(guò)硫酸銨0.1 g，ddH2O加至1 ml。
電泳緩沖液：Tris 3.02 g，甘氨酸14.4 g，SDS 1 g，ddH2O加至1000 ml。 轉(zhuǎn)膜緩沖液：Tris（15.6 mM）1.93 g，甘氨酸（120 mM）9 g，ddH2O至1000 ml。
凝膠制備：
成 分 30.8%丙烯酰胺 1.5M Tris（pH8.8） 0.5M Tris（pH6.8） 10%過(guò)硫酸銨 10%SDS TEMED H2O
12%分離膠（5 ml）
2.0 ml 1.3 ml
-- 0.05 ml 0.05 ml 0.002 ml 1.6 ml
5%濃縮膠（4 ml）
0.67 ml
-- 0.5 ml 0.04 ml 0.04 ml 0.004 ml 2.7 ml
步驟：將電泳槽裝置安裝好，根據(jù)需要量配置分離膠，灌注，用飽和正丁醇封液面，室溫30 min~60 min待膠凝固后，去除正丁醇，配制濃縮膠，灌注，將加樣梳放入，室溫30 min~60 min待膠凝固后即可上樣電泳；
（2）上樣：將蛋白質(zhì)標(biāo)本中加入2×Loading Buffer [0.2%（g/v）bromophenol blue, 4%（g/v） SDS, 20% glycerol，200 mM 2-mercaptoethanol（DTT）, 100 mM Tris（pH 6.8）]，煮沸5 min~10 min，12000 rpm離心后加樣；
（3）電泳：濃縮膠10 mA恒流電泳至交界處，分離膠20 mA恒流電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠下緣，可根據(jù)蛋白分子量的大小確定電泳的位置；
我們是bioworld的機(jī)子，一般可以電泳用恒壓80V跑到底。
5）Western blot分析
（1）半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（具體和實(shí)驗(yàn)室機(jī)子有關(guān)）：剪與凝膠大小一致的PVDF膜一張（膜用之前的處理：甲醇浸泡min,ddH2O浸泡5min，然后和濾紙一起泡到轉(zhuǎn)緩里），濾紙12張，浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中至少20 min，先將濾紙逐層置于轉(zhuǎn)膜儀上，用下膠尺逐層趕盡氣泡，加上PVDF膜，趕盡膜與濾紙間的氣泡，將聚丙烯酰胺凝膠放在PVDF膜上，趕盡凝膠與尼膜之間的氣泡，逐層加上濾紙，要盡量排放整齊；按照0.8 mA/cm2~1 mA/cm2的功率恒流轉(zhuǎn)膜2 h~2.5 h。注意正負(fù)極。
我們一般用的是250ma轉(zhuǎn)兩個(gè)小時(shí)。
（2）將PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的TBS中封閉2 h； （3）加入5%脫脂奶粉稀釋的一抗，4 ℃過(guò)夜； （4）次日用TBS洗3次，每次10 min； （5）加入HRP結(jié)合的二抗，37 ℃，1 h； （6）TBS洗4次，每次10 min；
（7）顯影：這個(gè)是根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備。
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