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植物組織培養(yǎng)
煙草的再生
前言 植物的組織培養(yǎng)廣義又叫離體培養(yǎng)，指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細(xì)胞，原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進(jìn)行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。狹義是指組培指用植物各部分組織，如形成層、薄壁組織、葉肉組織、胚乳等進(jìn)行培養(yǎng)獲得再生植株，也指在培養(yǎng)過程中從各器官上產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再經(jīng)過再分化形成再生植物。
在實(shí)踐中，根據(jù)所培養(yǎng)的植物材料的不同，可以把組織材料分為5種類型，即愈傷組織、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、器官培養(yǎng)（胚、花藥、子房、根和莖的培養(yǎng)等）、莖尖分生組織和原生質(zhì)體培養(yǎng)。這5種培養(yǎng)類型雖然各有特點(diǎn)，但又相互有聯(lián)系。例如，愈傷組織常常是懸浮細(xì)胞和原生質(zhì)體的來源，但是很多情況下，懸浮細(xì)胞和原生質(zhì)體最終又要通過形成愈傷組織才能產(chǎn)生再生植株。
19世紀(jì)30年代，德國植物學(xué)家施萊登和德國動(dòng)物學(xué)家施旺創(chuàng)立了細(xì)胞學(xué)說，根據(jù)這一學(xué)說，如果給細(xì)胞提供和生物體內(nèi)一樣的條件，每個(gè)細(xì)胞都應(yīng)該能夠獨(dú)立生活。1902年，德國植物學(xué)家哈伯蘭特在細(xì)胞全能性的理論是植物組培的理論基礎(chǔ)。1958年，一個(gè)振奮人心的消息從美國傳向世界各地，美國植物學(xué)家斯蒂瓦特等人，用胡蘿m.clearvueentertainment.com卜韌皮部的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，終于得到了完整植株，并且這一植株能夠開花結(jié)果，證實(shí)了哈伯蘭特在五十多年前關(guān)于細(xì)胞全能的預(yù)言。植物組培的簡單過程如下：剪接植物器官或組織——經(jīng)過脫分化形成愈傷組織——再經(jīng)過再分化形成組織或器官——經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)育成一顆完整的植株。植物組培的大致過程是：在無菌條件下，將植物器官或組織（如芽、莖尖、根尖或花藥）的一部分切下來，用纖維素酶與果膠酶處理用以去掉細(xì)胞壁，使之露出原生質(zhì)體，然后放在適當(dāng)?shù)娜斯づ囵B(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，這些器官或組織就會(huì)進(jìn)行細(xì)胞分裂，形成新的組織。不過這種組織沒有發(fā)生分化，只是一團(tuán)薄壁細(xì)胞，叫做愈傷組織。在適合的光照、溫度和一定的營養(yǎng)物質(zhì)與激素等條件下，愈傷組織便開始分化，產(chǎn)生出植物的各種器官和組織，進(jìn)而發(fā)育成一棵完整的植株。 植物組織培養(yǎng)具有很多優(yōu)點(diǎn)。第一，其培養(yǎng)條件可以人為控制，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災(zāi)害性氣候的不利影響，且條件均一，對(duì)植物生長極為有利，
便于穩(wěn)定地進(jìn)行周年生培養(yǎng)。第二，其生長周期短，繁殖率高。第三，管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制，與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲等一系列繁雜勞動(dòng)，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。
組織培養(yǎng)一方面可為轉(zhuǎn)基因育種提供理想的受體材料，另一方面又可為常規(guī)的植物改良程序提供一種新的手段，從而使很多用傳統(tǒng)方法難以解決的問題迎刃而解，更多更快地創(chuàng)造出各種農(nóng)作物和園藝植物的新品種、新類型和新種質(zhì)。總的來看，組織培養(yǎng)在植物改良中發(fā)揮了主要的作用，相信隨著培養(yǎng)的技術(shù)不斷的進(jìn)步，其將會(huì)發(fā)揮更大的作用。
一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>
1. 了解與掌握植物組織培養(yǎng)的原理和過程。
2. 了解與學(xué)習(xí)植物組織培養(yǎng)的相關(guān)操作技術(shù)。
3. 通過學(xué)習(xí)植物組織培養(yǎng)技術(shù)學(xué)習(xí)自我總結(jié)、自我反思，讓自己在今后的學(xué)習(xí)與生活中也能像做組織培養(yǎng)那樣細(xì)心、有條理。
二、 實(shí)驗(yàn)原理
動(dòng)物細(xì)胞的分化一般是不可逆的，植物則不同。只要具有一個(gè)完整的膜系統(tǒng)和一個(gè)有生命力的核，即使是已經(jīng)高度成熟和分化的細(xì)胞，也還保持著回復(fù)到分生狀態(tài)的能力。
把已分化組織中不分裂的靜止細(xì)胞從母體植株上分離下來置于一種能促進(jìn)細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)就會(huì)發(fā)生某些變化，例如在休止期間由于溶酶體的破壞活動(dòng)而喪失了功能的細(xì)胞組分又恢復(fù)了功能等，從而使細(xì)胞進(jìn)入分生狀態(tài)。一個(gè)成熟轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)并形成未分化的愈傷組織的現(xiàn)象稱作“脫分化”。在組織培養(yǎng)中，把如上述由活植物體上切取下來以進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官叫做外植體。外植體通常都是多細(xì)胞的，并且組成它們的細(xì)胞常常包括各種不同的類型，因此由一個(gè)外植體所形成的愈傷組織也是異質(zhì)性的，其中不同的組分細(xì)胞具有不同的形成完整植株的能力，即不同的“再分化”能力。
一個(gè)植物細(xì)胞能產(chǎn)生一個(gè)完整植株的固有能力稱這為細(xì)胞的全能性（Cell
totipotency）。換句話說，細(xì)胞全能性是指植物細(xì)胞具有全套遺傳信息，不管是性細(xì)胞還是體細(xì)胞，在特定環(huán)境下仍能進(jìn)行表達(dá)，而產(chǎn)生一個(gè)獨(dú)立完整的個(gè)體。
細(xì)胞一旦脫離了母體植株，擺脫了原來所受到的遺傳上的控制和生理上的制約，在一定的培養(yǎng)條件下，就會(huì)發(fā)生一種回復(fù)變化，從而失去分化狀態(tài)，變?yōu)榉稚?xì)胞，實(shí)現(xiàn)脫分化過程。然后，這些脫分化細(xì)胞經(jīng)過連續(xù)的有絲分裂，形成愈傷組織，即指在人工培養(yǎng)基上外植體長出來的一團(tuán)無序生長的薄璧細(xì)胞。
脫分化細(xì)胞不斷進(jìn)行分裂，從而形成了愈傷組織，愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時(shí)間以后，由于營養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，以及代謝產(chǎn)物的積累，必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這個(gè)過程叫做繼代。
當(dāng)試管苗在瓶內(nèi)長滿并長到瓶塞，或培養(yǎng)基利用完時(shí)就要轉(zhuǎn)接，進(jìn)行繼代，可迅速得到大量試管苗，以便到一定數(shù)量時(shí)進(jìn)行移栽。能否保持試管苗的繼代培養(yǎng)，是能否得到大量試管苗和能否用于生產(chǎn)的重要問題。
因此，按培養(yǎng)過程可分為初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)兩種類型：
（1）初代培養(yǎng)（Primary culture）：指外植體的最初培養(yǎng)。
（2）繼代培養(yǎng)（Subculture）：將初代培養(yǎng)得到的培養(yǎng)體移植于新鮮培養(yǎng)基中這種反復(fù)多次移植的培養(yǎng)，稱為繼代培養(yǎng)。
若按照組織培養(yǎng)的材料可分為：（1）組織、器官或細(xì)胞培養(yǎng)：指利用生物體各部分組織、器官或細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，使之形成愈傷組織或完整有機(jī)體的技術(shù)。
（2）原生質(zhì)體培養(yǎng)：指將微生物或植物細(xì)胞游離成原生質(zhì)體，在適宜培養(yǎng)條件下，依據(jù)細(xì)胞全能性使其再生細(xì)胞壁，并進(jìn)行細(xì)胞分裂分化，形成完整個(gè)體的技術(shù)。
植物組織培養(yǎng)過程為：
脫分化
再分化
三、 實(shí)驗(yàn)材料和儀器
材料：煙草的葉片， MS培養(yǎng)基所需的各類藥品，蔗糖，瓊脂，1mol/L的NaOH，
1mg/ml的6—ＢＡ，70%酒精，升汞溶液，無菌水
儀器：電子天平，玻璃棒，大燒杯，移液管，洗耳球，量筒，搪瓷杯，電爐，
ｐＨ計(jì)，漏斗，牛皮紙，培養(yǎng)皿，組培瓶，錐形瓶，濾紙，高壓蒸汽滅
菌鍋，無菌操作臺(tái)，鑷子，解剖刀，酒精燈
四、 實(shí)驗(yàn)步驟
（一）配制母液
１.根據(jù)書上的相關(guān)數(shù)據(jù)計(jì)算配制母液所需藥品的用量，和小組其他成員檢查核對(duì)數(shù)據(jù)，確定用量。（具體用量見表１）
２.將所需的藥品準(zhǔn)備好，按照表１的數(shù)據(jù)進(jìn)行母液的配制，配制好后寫好標(biāo)簽，按順序擺放好母液。
注意事項(xiàng)：
1.計(jì)算配制母液藥品用量時(shí)要小心仔細(xì)，不要出現(xiàn)計(jì)算錯(cuò)誤。計(jì)算完畢后應(yīng)和小組成員仔細(xì)核對(duì)，以確保計(jì)算無誤。
2.在稱取藥品時(shí)一定要看清藥品的名稱和用量，例如不要將K2HPO4 看成是KH2PO4。
3.配制完母液后要寫清標(biāo)簽，切勿弄混。
（二）MS培養(yǎng)基制備
1..在搪瓷杯里加入適量的水，按照表２，依次將溶液加入搪瓷杯中，攪拌。
2..將所得溶液定容到１Ｌ，調(diào)ｐＨ值，使ｐＨ＝６.０。
3.稱取瓊脂條10g，放入搪瓷杯中，放于電爐上加熱，待瓊脂條完全融化后將其
移開，置于室溫下冷卻。
4.待其冷卻一會(huì)兒（不燙手時(shí)）后將其分裝，總共分裝18瓶。用牛皮紙包好瓶
口，扎上棉線。
5.將其和組培瓶、剪刀、鑷子、培養(yǎng)皿、濾紙、裝有適量水的錐形瓶放入高溫滅
菌鍋中滅菌。表1
表2
注意事項(xiàng)：
1. 調(diào)試pH值要在加熱之前，因?yàn)闇囟葧?huì)影響溶液的pH。
2. 在加熱過程中要有人照看，以免溶液因?yàn)榉序v而噴灑出來。
3. 在分裝時(shí)一定要小心，勿將液體培養(yǎng)基倒在瓶口上，如不小心沾上，要小心擦拭干凈。
（三）初代培養(yǎng)的接種
1. 將所需用具組培瓶、培養(yǎng)皿、濾紙、鑷子、解剖刀、無菌水從滅菌鍋取出，準(zhǔn)備好75%的酒精，升汞，酒精棉，酒精燈，將它們按一定順序排好待用。
2..接種前用酒精棉擦手，然后換一塊酒精棉擦拭工作臺(tái)面，再換一塊酒精棉擦拭鑷子和解剖刀，在等待酒精揮發(fā)的同時(shí)將錐形瓶的棉線解開，將棉線理好后放在腿上。
3.采集一片長勢完好的煙草葉片，用75%酒精浸泡數(shù)秒鐘，然后用升汞溶液浸泡3min到5min，之后取出，用無菌水漂洗3次。
4.將消毒后的葉片置于無菌濾紙上，用解剖刀將葉片邊緣和兩端切去，留下主脈及其附近的葉肉，后將剩下的葉片切成1cm2左右大小的外植體。
5.左手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶底部，右手輕輕取下包頭紙，將錐形瓶的瓶口靠近酒精燈火焰，瓶口傾斜，。然后用灼燒后冷卻的鑷子將外植體移入瓶中，葉片背面與培養(yǎng)基接觸，輕輕按壓使植物能緊貼培養(yǎng)基。鑷子使用后放回消毒酒精中，將瓶口在火焰上旋轉(zhuǎn)灼燒數(shù)秒鐘，后包扎好瓶口，作好標(biāo)記。
6.定期觀察煙草的葉片的生長狀況，及時(shí)記錄并拍照。
注意事項(xiàng)：
1.用酒精棉給手和臺(tái)面以及鑷子和解剖刀消毒時(shí)要離酒精燈遠(yuǎn)一點(diǎn)，待酒精揮發(fā)干后才可以靠近酒精燈，避免發(fā)生危險(xiǎn)。
2.用升汞消毒時(shí)要避免消毒時(shí)間過長，以免破壞其組織。在消毒過程中要適時(shí)晃動(dòng)一下組培瓶，使葉片與升汞充分接觸。
3.切葉片時(shí)切忌切的太小。
4.取下的牛皮紙向下擺放，放好葉片再次用牛皮紙包上錐形瓶之前要用火燒一下瓶口，切忌牛皮紙碰到瓶口。
五、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
第一次觀察
第二次觀察
六、 實(shí)驗(yàn)分析與討論
通過照片可以看出，此次實(shí)驗(yàn)成功地長出了愈傷組織。愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時(shí)間以后，由于營養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，以及代謝產(chǎn)物的積累，必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)。此次實(shí)驗(yàn)由于課時(shí)的限制，所以只進(jìn)行了初代培養(yǎng)。
植物組織培養(yǎng)是看似簡單實(shí)則是很不容易的一門技術(shù)。它要求我們每次做實(shí)驗(yàn)都必須要認(rèn)真、仔細(xì)、有條理。不管是哪一次實(shí)驗(yàn)，只要其中的一個(gè)環(huán)節(jié)出錯(cuò)，就有可能導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)的失敗。所以，認(rèn)真仔細(xì)有條理是做組培的基本條件。
在這次實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過回想與總結(jié)，得出了以下的一些經(jīng)驗(yàn)：
1.大量元素的配制：
首先是要確定藥品，不要將藥品名稱看錯(cuò)。例如不要將K2HPO4 看成是KH2PO4。 這兩樣?xùn)|西看起來雖然差不多，其實(shí)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生很大的影響。KH2PO4是酸性的，在此
次實(shí)驗(yàn)中和其他藥品不會(huì)產(chǎn)生沉淀，而K2HPO4是堿性的，在此次實(shí)驗(yàn)中會(huì)和Mg2+形成
沉淀，影響實(shí)驗(yàn)。在配制大量元素?zé)o機(jī)鹽母液時(shí)，還要防止在混合各種鹽類時(shí)產(chǎn)生沉淀，各種藥品必須在充分溶解后才能混合，同時(shí)在混合時(shí)要注意先后次序，把鈣離子(Ca2+)、錳離子(Mn2+)、鋇離子(Ba2+)和硫酸根離子(SO42-)、磷酸根離子(PO43-)錯(cuò)開，以免KH2PO4和MgSO4與CaCl2等發(fā)生作用，相互結(jié)合生成硫酸鈣、硫酸鋇、磷酸鈣或磷酸錳沉淀。在混合各種無機(jī)鹽時(shí)，其稀釋度要大，慢慢地混合，同時(shí)邊混合邊攪拌。
2.微量元素的配制：
在配制微量元素混合母液時(shí)也要注意藥品的添加順序，以免產(chǎn)生沉淀。
3.鐵鹽的配制：
鐵鹽必須單獨(dú)配制，因?yàn)榕c其他母液混合容易產(chǎn)生沉淀，在培養(yǎng)基中，采用螯合鐵的形式配制，即硫酸亞鐵和Na2-EDTA的混合物，在pH值7.6~8.0時(shí)也可保證鐵的供應(yīng)源。
4.母液的保存：配制好的母液應(yīng)分別貼上標(biāo)簽，注明母液號(hào)、配制倍數(shù)、日期。
5.MS培養(yǎng)基配制過程，要注意調(diào)試pH是在加熱之前，不能加熱之后再調(diào)pH，因?yàn)闇囟葧?huì)對(duì)其產(chǎn)生影響，會(huì)導(dǎo)致pH偏大。在分裝的過程中要注意不要將培養(yǎng)基倒在瓶口
上，這樣容易受污染。如不小心瓶口沾上，要小心將其擦拭干凈。
6.初代培養(yǎng)接種過程，在開始的時(shí)候不要急著做實(shí)驗(yàn)，要將所有的東西準(zhǔn)備好，先在大腦里演示一遍整個(gè)實(shí)驗(yàn)的過程以及注意事項(xiàng)，確定無誤后再開始做實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中一定要保持頭腦冷靜，做到有條不紊。
整個(gè)組培的學(xué)習(xí)過程是有趣的，通過這次的學(xué)習(xí)，知道了自己的一些不足，在以后的學(xué)習(xí)生活中，我會(huì)一點(diǎn)一點(diǎn)的改正。
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